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タンパク質デザインを目指した一分子ソーターの開発

本研究の目的

ファージ・ディスプレイ法と蛍光観察装置を組み合わせ、さまざまな配列を持つライブラリーから、目的の特性を持つタンパク質を選択する実験手法を確立する。

焦点深度の大きな光学系を開発し、バルブと組み合わせることで一分子の信号検出の後に試料を回収するシステムを開発しています。

GFPを再構成したファージを一分子選別装置に流し、一個体ごとに観察しながら選別する実験を続けています。

今までに、

①作製したファージを一個体ごとに計測していることを確認した。

②装置から回収したファージを大腸菌に感染させることで、配列情報を読み取れることを確認した。

現在、効果的にファージを回収する方法を模索中です。

マイクロ秒分解一分子 観察法によるタンパク質の高速度ダイナミクスの観察

研究の目的

数十マイクロ秒の時間分解能で、一分子の蛍光強度変化を連続追跡するライン型共焦点蛍光観察装置を開発し、タンパク質の高速ダイナミクスを追跡する。

フローセルとラインフォーカス型の共焦点顕微鏡を用いて、20 マイクロ秒の時間分解能による一分子蛍光観察を可能にした。この時間分解能は、従来の実験装置よりも一桁以上の向上に対応する。しかし、時間分解能を向上させると、測定時間を十分に長く出来ず、せいぜい数ミリ秒の長さの時系列データしか得られないとう欠点があった。

高時間分解能を維持しながら長時間観察が可能な一分子蛍光時系列データ観察装置を開発した。

装置の性能を評価すると、予備的な結果として、10マイクロ秒の時間分解能で10ミリ秒以上のデータの取得を可能にした。この装置を用いることで、分子動力学計算で示されるタンパク質の運動を、実験的な手法によって検証する実験が可能になると考えられる。

開発した装置を用いることで、いくつかのタンパク質についての一分子計測を行い、得られた一分子データを解析するための手法の開発も行った。

プロテインAのBドメイン:得られたデータの線幅を解釈するための理論を構築し、データをほぼ定量的に説明できることを明らかにした。

ユビキチン:定常状態における変性過程の一分子計測を完了し、さらに、溶液混合装置を用いた時間分解能計測の予備実験を行った。

青色蛍光タンパク質:平衡変性過程についての一分子観察を行った。さらに、分子シャペロンであるGroELとの相互作用を計測した。

スタフィロコッカルヌクレアーゼ:一分子計測実験の準備を開始している。

一分子蛍光観察法を用いた天然変性蛋白質p53の運動解析

研究の目的

DNA上におけるp53の運動を直接観察し、ターゲット配列を探し出す分子機構を解明する。

がん抑制蛋白質であるp53は、細胞周期の調整などを担う重要な蛋白質である。p53が機能を発現するためには、DNA上のターゲット配列を探し出して特異的に結合する必要がある。この過程は驚くほど短時間内に起きることが知られているが、そのメカニズムは明らかにされていない。そこで、私たちは、自作の蛍光顕微鏡を用いて、蛍光色素修飾p53が基板に固定されたDNA上を動く過程を直接観察することで、p53の機能の解明を目指している。これまでに、伸長したDNA上を一次元拡散運動する多数のp53粒子を観測することに成功している。得られたp53の運動データを解析することで、

①2つの探索運動
②2価の陽イオンによる探索運動の加速
③ターゲット配列への結合効率が低い
以上のことを明らかにしている。
さらに、DNA配列とp53の探索の関連性を明らかにし、単分子解析でより多くの粒子を観測するため、DNAを基盤に整列させる技術を開発している。また、この技術を用いて、がん化変異体、活性化変異体などの機能解析を行っている。このように、生物物理的な装置開発を通して、がん抑制蛋白質p53の機能解析を進めている。