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タンパク質デザインを目指した一分子ソーターの開発

本研究の目的

ファージ・ディスプレイ法と蛍光観察装置を組み合わせ、さまざまな配列を持つライブラリーから、目的の特性を持つタンパク質を選択する実験手法を確立する。

焦点深度の大きな光学系を開発し、バルブと組み合わせることで一分子の信号検出の後に試料を回収するシステムを開発しています。

GFPを再構成したファージを一分子選別装置に流し、一個体ごとに観察しながら選別する実験を続けています。

今までに、

①作製したファージを一個体ごとに計測していることを確認した。

②装置から回収したファージを大腸菌に感染させることで、配列情報を読み取れることを確認した。

現在、効果的にファージを回収する方法を模索中です。

マイクロ秒分解一分子 観察法によるタンパク質の高速度ダイナミクスの観察

研究の目的

数十マイクロ秒の時間分解能で、一分子の蛍光強度変化を連続追跡するライン型共焦点蛍光観察装置を開発し、タンパク質の高速ダイナミクスを追跡する。

フローセルとラインフォーカス型の共焦点顕微鏡を用いて、20 マイクロ秒の時間分解能による一分子蛍光観察を可能にした。この時間分解能は、従来の実験装置よりも一桁以上の向上に対応する。しかし、時間分解能を向上させると、測定時間を十分に長く出来ず、せいぜい数ミリ秒の長さの時系列データしか得られないとう欠点があった。

高時間分解能を維持しながら長時間観察が可能な一分子蛍光時系列データ観察装置を開発した。

装置の性能を評価すると、予備的な結果として、10マイクロ秒の時間分解能で10ミリ秒以上のデータの取得を可能にした。この装置を用いることで、分子動力学計算で示されるタンパク質の運動を、実験的な手法によって検証する実験が可能になると考えられる。

開発した装置を用いることで、いくつかのタンパク質についての一分子計測を行い、得られた一分子データを解析するための手法の開発も行った。

プロテインAのBドメイン:得られたデータの線幅を解釈するための理論を構築し、データをほぼ定量的に説明できることを明らかにした。

ユビキチン:定常状態における変性過程の一分子計測を完了し、さらに、溶液混合装置を用いた時間分解能計測の予備実験を行った。

青色蛍光タンパク質:平衡変性過程についての一分子観察を行った。さらに、分子シャペロンであるGroELとの相互作用を計測した。

スタフィロコッカルヌクレアーゼ:一分子計測実験の準備を開始している。

DNA結合タンパク質の単分子機能解析および人工設計

研究の目的

単分子蛍光顕微鏡とDNA整列固定技術を用いて、DNA上におけるDNA結合タンパク質の運動を観察し、その機能に関する分子機構を解明する。

DNA結合タンパク質は、遺伝子を含むDNAに結合し、細胞の機能を制御している。DNA結合タンパク質が機能を発現するためには、DNA上のターゲット配列を探し出して特異的に結合する必要がある。この過程は驚くほど短時間内に起きることが知られているが、そのメカニズムは明らかにされていない。そこで、私たちは、開発した蛍光顕微鏡やDNA整列固定技術”DNAガーデン”を用いて、蛍光色素修飾したDNA結合タンパク質が基板に固定されたDNA上を動く過程(スライディングやジャンプなど)を直接観察することで、DNA結合タンパク質の機能の解明を目指している。

モデルタンパク質:

・がん抑制タンパク質p53

・DNAの形を制御するタンパク質Fis, Nhp6A, HU

・ゲノム編集タンパク質Cas9

さらに、DNA結合タンパク質の機能を制御するペプチドの人工設計、機能の向上を目指したDNA結合タンパク質の人工設計、DNA結合タンパク質が関与する液液相分離現象の解明とその制御に挑戦している。